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      新聞動態

      陳寶惠團隊在NAR上發表TriTag新技術“點亮”中心法則中的三大組分

      來源 :基礎醫學系    發布時間 :2020-10-29    瀏覽次數 :514

      20201026日,浙江大學基礎醫學院、浙江大學附屬第一醫院陳寶惠團隊在Nucleic Acids Research雜志在線發表題為“TriTag: an integrative tool to correlate chromatin dynamics and gene expression in living cells”的論文,在單個活細胞內實現了內源特異蛋白編碼基因的DNA、新生RNA和蛋白產物的三重實時可視化,因此命名為“TriTag”技術。

      “眼見為實”的活細胞成像技術,讓細胞世界在生命過程中的各種瞬間能夠被直觀、連續地進行記錄和探索。生物分子標記技術是生物分子成像的關鍵。把熒光蛋白用于生命科學領域,開啟了細胞研究的巨大革命,是基礎科學及人類重大疾病研究中最重要的研究工具之一[1]。隨著生物分子標記技術的不斷發展,熒光蛋白能夠分別點亮細胞內的DNA、RNA和蛋白質等分子。

      為全面了解細胞核的動態調控和功能,美國國立衛生研究院(NIH)在2014年提出了“4D核組計劃4D Nucleome Project),旨在時間和空間尺度上,結合單細胞測序、單細胞成像等前沿技術,深入理解哺乳動物細胞核的三維結構形成原理及其對基因表達、細胞功能、個體發育和疾病發生發展的影響[2]。因此,細胞核內DNARNA到蛋白的信息傳遞及三者之間的相互協作如何精準實現具有時空特異性的基因表達模式,從而實現特異的細胞及生物個體功能,成為科學家們新的挑戰。

      TriTag技術通過CRISPR-Cas9介導的DNA重組方法,在特異蛋白編碼基因的N端或C端插入一段1.5 kbTriTag標簽,即可集合 DNA、RNA和蛋白三大活細胞成像系統于同一個細胞。這個策略能夠直接關聯染色質和基因表達(包括轉錄水平和蛋白產量)的動態變化,直觀理解中心法則的信息傳遞(圖1)。該技術可在單個等位基因的分辨率下研究基因轉錄的時空特異性及其動態調控。

      1. TriTag技術在活細胞內同時可視化DNA、新生mRNA和蛋白的原理示意圖

      TriTag技術的創新之處是在編碼熒光蛋白的DNA序列中添加了一段長約為100個堿基的內含子,并在內含子內加入了可用于DNA成像的CRISPR-Tag元件[2]和可用于RNA成像的MS2基序元件[3]。TriTag成像系統的建立,首先是在細胞內同時表達了dCas9-GFP14XstdMCP-tdTomato雙色熒光報告系統,分別用于DNARNA成像。在這個雙色穩定細胞系的基礎上,可以在感興趣的蛋白編碼基因的N端或C端插入藍色熒光蛋白版本的TriTag標簽,即可實現在活細胞狀態下實時記錄該基因的染色質狀態、轉錄水平、蛋白產量和蛋白的亞細胞定位(圖2)。

      2 TriTag技術實現人基因的DNA、mRNA和蛋白的三重可視化

      TriTag技術將MS2序列放在了熒光蛋白的內含子內,新生RNA一旦在轉錄中心產生,就能被stdMCP-tdTomato識別并標記。由于mRNA的內含子剪切發生較快,剪切發生后,成熟mRNA不再帶有MS2序列而不再被標記。因此轉錄中心新生RNA的累積量能實時指示轉錄水平高低。通過活細胞實時成像分析,TriTag系統揭示了管家基因H2BLMNA的轉錄是一個間歇性的爆發式過程,簡稱轉錄爆發(transcriptional bursting),即轉錄以的模式進行轉錄。H2BLMNA基因呈現出不同的轉錄爆發強度(burst amplitude)和爆發頻率(burst frequency)(圖3)。隨著活細胞RNA標記技術的發展,已有不少研究表明了轉錄爆發的保守性[4]。然而以往的策略大多數把MS2序列插入到靶基因的5’3’UTR,有可能影響靶基因的蛋白表達。TriTag技術的進步在于把MS2序列放置于熒光蛋白的內含子中,在不影響靶基因的蛋白表達前提下,可實時記錄轉錄爆發模式。同時靶基因位點的DNA標記使得分析更加精確,加上蛋白的表達與定位成像,使得分析更加全面和深入。

      3 TriTag技術記錄基因轉錄水平的實時波動

      TriTag成像可在細胞周期的各個階段中實現,在單個基因位點的分辨率下,對轉錄水平與染色質動態進行實時定量分析。該工作運用TriTag技術揭示了以下幾點非常有意思的生命現象:1)有絲分裂S期,DNA一旦復制,子鏈上的基因能夠與母鏈上的基因保持一樣的轉錄狀態(圖4);2)有絲分裂結束后,母細胞中的基因轉錄狀態能夠被兩個子細胞繼承;3)轉錄活性高的染色質區域被限制在更小的范圍內運動。原因可能是該染色質區域位于轉錄因子高度聚集的轉錄中心,該區域形成相分離的液滴[5],促進轉錄高效進行;4)基因的轉錄水平大幅升高之前,實時成像顯示染色質可能經歷了從致密到開放的急劇轉變,而這一轉變又依賴于轉錄的發生。TriTag技術將DNA、RNA、蛋白三大成像技術集合成一個在單個細胞內同時實現的成像體系。這樣的活細胞成像方式能夠捕捉更完整的生命反應。本質上TriTag是一個熒光蛋白標簽,但其巧妙的設計賦予了它更多的功能,能更精確地將多個層次的現象直接整合起來分析,有利于推導出更嚴謹的科學結論。因此,TriTag的運用將在活細胞水平上更好地解析基因表達的時空調控,有望幫助回答印記基因調控、轉錄記憶(transcriptional memory)及轉錄-復制沖突(transcription-replication conflicts)等生物學問題。

      4 TriTag技術記錄細胞分裂中的基因轉錄動態

      浙江大學基礎醫學院博士研究生徐海月為該研究的第一作者。參與此項工作的作者還包括研究生王君巖、梁鷹、扶玉娟、李思卉、本科生黃靖涵。浙江大學基礎醫學院陳寶惠研究員為該研究的通訊作者。該研究得到了浙江大學轉化醫學研究院鄒煒研究員和上海交通大學物理與天文學院徐恒研究員的大力支持。

      原文鏈接: https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkaa906/5940501

      參考文獻

      1. Specht, E.A., E. Braselmann, and A.E. Palmer, A Critical and Comparative Review of Fluorescent Tools for Live-Cell Imaging. Annu Rev Physiol, 2017. 79: p. 93-117.

      2. Dekker, J., et al., The 4D nucleome project. Nature, 2017. 549(7671): p. 219-226.

      3. Chen, B., et al., Efficient labeling and imaging of protein-coding genes in living cells using CRISPR-Tag. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5065.

      4. Bertrand, E., et al., Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell, 1998.2(4):p. 437-45.

      5. Suter, D.M., et al., Mammalian genes are transcribed with widely different bursting kinetics. Science, 2011. 332(6028): p. 472-4.

      6. Plys A.J., Kingston R.E. Dynamic condensates activate transcription. Science, 2018. 361(6400): p. 329-330.


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